Проект "Изучение Elodea Canadensis с помощью молекулярно-генетических методов"

Солодуша Петр

г. Иркутск, МБОУ Лицей №1, 8 класс

Руководители: Минчева Елена Вячеславовна (к.б.н., ЛИН СО РАН),

Савельева Алефтина Ивановна (учитель биологии, МБОУ Лицей №1)

Развитие промышленности, сельского хозяйства, экономических отношений в XX веке послужило причиной для изменений в экосистемах. Особое повреждающее действие, влияющее на видовое разнообразие экосистем, вносят вселения (инвазии) чужеродных видов. Одним из самых известных и агрессивных видов растений является элодея канадская Elodea сanadensis. Родина растения – Северная Америка. Отдел – покрытосеменные, класс – однодольные, семейство – водокрасовые, род – элодея.

В настоящее время элодея распространилась в Атлантической Европе, Средиземноморье, Скандинавии, Азии и Австралии. В Сибири элодея проникла в бассейны рек Оби, Енисея, Лены. В 1980 г. (по другим данным, в 1976 г.) элодея канадская обнаружена в озере Байкал. Несмотря на то, что Байкал обладает сильным механизмом самозащиты и в той или иной мере препятствует проникновению и натурализации в его водах чужеродных видов, но, тем не менее, элодея, проникнув в озеро в 1970-годах, очень быстро смогла практически полностью захватить его территорию [1]. Широко распространена элодея и в водоемах Бурятии, Читинской области [2].

Актуальность исследования. Установлено, что бурное развитие элодеи влияет на прозрачность, температуру, содержание кислорода и кислотность воды. Кроме того, она вытесняет другие виды растений, ее густые заросли могут стать препятствием для плавания маломерных судов и рыболовства, а в зимнее время разлагающиеся растения вызывают заморы рыбы. Таким образом, проблема предотвращения и контроля нежелательных инвазий этого растения является чрезвычайно важной.

Цель исследования – с помощью молекулярно-генетических методов проследить генетические изменения и адаптацию растения к новым условиям обитания.

Данная работа посвящена выделению ДНК E. canadensis для последующего изучения внутривидового генетического разнообразия.

Основные задачи состояли в следующем: изучить предметную область, выполнить лабораторные работы по выделению и анализу ДНК, сделать обучающую игру для составления молекулы ДНК в редакторе электронных таблиц Microsoft Excel.

Образцы растений были собраны в июле 2014 года в озере Байкал и озере Шакша (Читинская область) и зафиксированы 80% этанолом. В данной работе использовалась методика выделения ДНК из листовой ткани, оптимизированная в лаборатории геносистематики Лимнологического института СО РАН. Эта методика основана на применении гуанидин изотиацианата в качестве лизирующего раствора.

Кусочек листовой ткани E. сanadensis поместили в 1.5 мл пробирку и добавили четырехкратный объем 4М гуанидин изотиоцианата (≈ 400 мкл). Биомассу растерли пестиком, инкубировали при 65°С в течение 1 часа. Затем добавили 400мкл фенола и инкубировали при 65°С в течение 30 мин. Далее остудили при комнатной температуре, добавили 500 мкл хлороформа и перемешали содержимое пробирки на вортексе. Центрифугировали 10 мин. при максимальных оборотах. Отобрали верхнюю фазу в чистые пробирки, добавили равный объем холодного изопропанола и оставили пробирки на ночь в морозильнике при -20°С. После этапа осаждения отобрали по 100 мкл смеси ДНК и изопропанола в новые чистые микропробирки. Центрифугировали в течение 10-15 мин. на максимальных оборотах, слили верхнюю фазу и промыли осадок 3 раза 80%-ым этанолом. Осадок подсушили при 37° С в течение 5-10 мин. и растворили в 30 мкл milliQ-воды. Растворенную ДНК в дальнейшем рекомендуется хранить в морозильнике при -20°C [3]. Качество выделенной ДНК оценивали путем измерения концентрации на спектрофотометре Bio-Rad SmartSpec^TM Plus и электрофоретически в 1% агарозном геле. Качество ДНК оценивали по соотношению поглощения при длинах волн 260/280 нм. Оптимальный показатель – 1.8-2.0. На рисунке 1 представлены результаты одного из измерений.

Рис. 1. Бланк измерений концентраций ДНК на спектрофотометре.

Выделение ДНК – это первый шаг в проведении молекулярно-генетических исследований. Качество и чистота нуклеиновых кислот относятся к одним из самых важных факторов ПЦР-анализа. Преимуществом данной методики является скорость выделения (общее время порядка 3 часов) и качество полученной ДНК.

С целью повышения интереса школьников к изучению ДНК мною была сделана небольшая игровая программа-тренажер для работы с мышкой. Используя графические примитивы Microsoft Excel, я выполнил основные элементы–шаблоны. Программный код был сформирован с помощью визуальной записи макроса в Microsoft Excel.

При выполнении проекта я узнал о важности сохранения экосистем от чужеродных видов, научился выделять ДНК. Выделенная таким образом ДНК пригодна для дальнейших молекулярно-генетических манипуляций, в частности ПЦР.

В дальнейшем я планирую продолжить сбор образцов элодеи из разных водоемов, выделение ДНК и изучение ее генетического разнообразия с целью изучения путей расселения и адаптации этого растения по водоемам Восточной Сибири.

Список литературы.

1. Базарова Б.Б., Пронин Н.М. Элодея канадская в Чивыркуйском заливе озера Байкал // География и природ. ресурсы. – 2006. – №. 1. – С. 59-62.

2. Базарова Б.Б. Многолетние изменения растительности озера Кенон (Забайкальский край) // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». – 2012. – №. 4. – С. 18-25.

3. Темралеева А.Д., Минчева Е.В., Букин Ю.С., Андреева А.М. Современные методы выделения, культивирования и идентификации зеленых водорослей (Chlorophyta). – Кострома: Костромской печатный дом, 2014. С.89-94.