Генетическая инженерия. Перспективы, достижения

Генетическая инженерия, достижения и перспективы

Генетическая инженерия — совокупность методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

История развития

В 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.

1953 год – открытие структуры ДНК.

Дата рождения молекулярной биологии

История развития

• На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально.
• В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

• Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro.
• Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
• Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

1972-1973 гг. – рождение генетической инженерии

Пол Берг

Герберт Бойер

Стенли Коэн

Создание первой рекомбинантной молекулы ДНК: вирус SV 40, бактериофаг λ и E. coli.

Создание технологии клонирования изолированных генов вклетках бактерий в составе плазмид (векторов)

Основные этапы создания трансгенных клеток и организмов

1. Получение изолированного гена

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Ферменты генетической инженерии

Основными ферментами, которые используются в генетической инженерии, являются:

• рестриктазы
• лигазы
• ДНК- полимеразы
• обратные транскриптазы (ревертазы)

Достижения и перспективы генетической инженерии

• 1. Генетическая инженерия микроорганизмов;
• 2. Генетическая инженерия растений;
• 3. Генетическая инженерия животных;
• 4. Генная терапия.

Генная инженерия микроорганизмов

А.Чакрабарти

1980 г. – начало промышленной генной инженерии микроорганизмов. Выдан первый патент на генно-инженерный штамм микроорганизма, способный разлагать нефть.

Еще через 2 года был разрешен для клинического использования полученный из бактерии 1-й лекарственный препарат – человеческий инсулин.

В. Г. Дебабов

Ю. А.Овчинников

В нашей стране Ю. А. Овчинников и В. Г. Дебабов с сотрудниками получили микроорганизмы, эффективно синтезирующие интерферон человека (до 5 мг интерферона на 1 л суспензии бактерий, что в 5000 раз больше, чем содержится в 1 л крови доноров).

Получение бактерии E. coli со встроенным геном соматотропина – гормона роста человека, который используется не только в медицинских целях, но и в практическом животноводстве, повышая с его помощью интенсивность роста животных.

Генная инженерия растений

+

Первое в мире химерное растение  санбин  (sunbeаn )  как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника ( sunflower  +  beаn ).

Устойчивость к вредителям

Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный эндотоксин  Bacillus thuringiensis .

Эта бактерия продуцирует крупный белок-предшественник эндотоксина, контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник личинок насекомых, активируется под действием ферментов и приводит к их гибели.

Иммунитет

Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы, были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген H 2 O 2  - перспективный приём для создания устойчивых трансгенных растений.

Регуляция сроков хранения плодов

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал «перевернутую» последовательность к-ДНК гена PG, контролирующего синтез  полигалактуроназы  - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей.

Регуляция сроков созревания плодов

В качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена.  Этилен  - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Повышение урожайности, регуляция скорости роста

Встраивание в геном картофеля гена фитохрома В от арабидопсиса привело к повышению интенсивности фотосинтеза и увеличению урожая клубней.

По данным российских ученых ( Р.К. Саляев и др.) из Иркутского университета перенос в геном картофеля гена, кодирующего образование фермента УДФГ трансферазы созревающего зерна кукурузы, сопровождался усилением биосинтеза ростовых фитогормонов. Это позволило повысить урожай клубней в 2 раза, уровень сухих веществ до 27% (у обычных сортов менее 20%), аскорбиновой кислоты до 9 %. Разрезанные клубни не темнели на воздухе.

Ведутся работы и получены обнадеживающие результаты по созданию кофе без кофеина, табака без никотина (полагают, что курение сигарет из такого табака будет менее вредным для здоровья), арахиса, не содержащего характерного для него аллергенов.

Швейцарским ученым удалось разработать генно-инженерный подход создания так называемого «золотого» риса.

Они перенесли в геном риса генетическую конструкцию, содержащую сразу три гена от разных организмов, необходимых для биосинтеза β-каротина: гены фитоендесатуразы и ликопин β- циклазы от нарцисса и ген каротиндесатуразы от бактерии.

Ведутся работы по созданию трансгенных растений лесных древесных пород с пониженным содержанием лигнина. В создании низколигниновых деревьев заинтересована целлюлозно-бумажная промышленность, т.к. лигнин, который составляет 15-35% от сухого вещества в древесине при производстве бумаги– «лишний» компонент, а его удаление – дорогостоящий и экологически опасный процесс.

Устойчивость к абиотическим стрессам

Один из генно-инженерных подходов для решения этой проблемы – клонирование и встраивание в геном растения гена, кодирующего белок животного происхождения – металлотионенина, способного связывать многие тяжелые металлы. Выделен ген, продукт которого связывает кадмий.

Г. Джиа с соавторами в 2002 году получил трансгенные томаты, экспрессирующие бетаинальдегиддегидрогиназу (учавствует в синтезе глицинбетаина) лебеды Atriplex hortensis и проявляющие достаточно высокую устойчивость к солевому стрессу.

Декоративные свойства

На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума

Получение растений петунии с разноцветными цветками.

Получены и испытываются трансгенные растения хлопка с окрашенным волокном. Предполагается, что в будущем натуральное хлопковое волокно станет крепче, не будет мяться, садиться и будет иметь различную химическую окраску без использования химических красителей.

Метаболическая инженерия

Главная задача: научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, съедобные вакцины и др.

Растения – фабрика белков

Японские ученые получили растения картофеля и табака со встроенным геном человеческого интерферона альфа, который применяют для лечения человека от гепатита С и некоторых форм рака.

• Созданы растения табака с человеческим интерлейкином 10 (стимулятор иммунитета)
• растения арабидопсиса, синтезирующие витамин Е.
• Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Так, получен картофель, продуцирующий нетоксичные субъединицы B-токсина холеры .

Индуцированный партеногенез

Плод груши без семян

Бессемянный арбуз

В последние годы в практической селекции используется еще одно направление. Оказалось, что плоды трансгенных растений с бактериальным геном iaaM (ген контролирует один из этапов биосинтеза ауксина), находящегося под промотором гена Def ( ген, который экспрессируется только в плодах) являются партенокарпическими, т.е. сформировавшимися без опыления.

Генетическая инженерия животных

Первое трансгенное животное было получено в 1982 г. Р.Д. Пальмитером с соавторами. Это была гигантская мышь, которой пересадили ген гормона роста крысы

Трансгенные животные -биореакторы

Трансгенные животные получили широкое распространение как продуценты биологически активных лекарственных белков человека, секретируемых в молоко: гормонов, ферментов, антител, факторы свертываемости крови и т.д.

Создают генетическую конструкцию, содержащую рекомбинантную ДНК трансгена и промотор гена β-казеина – белка входящего в состав молока. Т.е. под, промоторами генов, специфичных для молочных желез (α-, β-казеина, лактоальбуминаили -лактоглобулина), вводят целевые гены, которые нарабатывают биологически активные вещества. Генетическую конструкцию инъецируют в зиготу. Причем, эта конструкция должна работать только в клетках молочной железы и только во время лактации, не оказывая побочного воздействия на организм трансгенного животного .

Трансгенная Полли и ее сестры

Трансгенные козы

В геноме этих коз содержится человеческий ген антитромбин III, препятствующего свертыванию крови. Белок выделяется с молоком.

В геноме Полли содержится человеческий ген IX фактора свертываемости крови. Ген работает в клетках молочной железы, и белок нужный для лечения гемофилии, выделяется с молоком.

Так, с помощью гена -антитрипсина ААТ, помещенного под контроль промотора гена-лактоглобулина были получены трансгенные козы, в молоке которых содержится до 35г/л этого белка. -антитрипсин является ингибитором протеазы эластазы.

Первые в мире трансгенные животные (овцы), продуцирующие с молоком прохимозин крупного рогатого скота были получены в России в 1995 году. Химозин – ключевой фермент сыроделия, и традиционно его выделяют из слизистой оболочки сычуга забитых молочных телят и ягнят.

Трансгенные животные как генетические модели наследственных заболеваний человека

По данным секвенирования генома у мыши и человека содержится около 70-80% гомологичных генов. На этом объекте можно получать мутации, осуществлять генно-инженерные манипуляции и изучать механизмы регуляции экспрессии генов, проводить скрещивание трансгенных животных и анализ наследования в потомстве, что недопустимо с человеком.

Путем введения в геном мыши генов, ответственных за конкретное заболевание человека, созданы «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгеймера (старческое слабоумие, дегенеративная болезнь), артрит, атеросклероз, мышечная дистрофия (миодистрофия Дюшенна), образование опухолей, гипертония, сердечно-сосудистые и прионные заболевания и др.

В январе 2002 г. компания PPL Therapeutics pic объявила о рождении в США пометов трансгенных клонов свиньи с отключенными генами гистонесовместимости.

Интересны и перспективны работы по созданию животных - продуцентов белка паутины пауков, поскольку прочность на разрыв нитей паутины в расчете на площадь поперечного сечения напорядок превосходит прочность стальных канатов. Так, перенеся в геном коз гены паука, отвечающие за выработку паутины, американские и канадские генетики получили трасгенных животных, продуцирующих «биосталь» – молоко, содержащее белок, по прочности превосходящий металл.

Генная терапия

Генная терапия – это устранение генетических дефектов (коррекция наследственных патологий) путем введения в соматические клетки полноценных (функционально активных) генов вместо (или помимо) поврежденного (мутантного) гена.

Методы генной терапии

Для переноса генов чаще всего используют относительно легко доступные клетки: фибробласты, лимфоциты, клетки печени - гепатоциты, каратиноциты, эндотелиальные и мышечные клетки, стволовые клетки костного мозга. Такие клетки можно извлечь из организма, включить в них нужную генную конструкцию, провести отбор и культивирование in vitro трансформированных клеток, а затем вновь ввести их (реимплантировать) в организм больного. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой.

Достижения

Первая успешная попытка применить генотерапию в клинической практике была предпринята в 1990 году в США для излечивания у 4-летнего ребенка иммунодефицита, обусловленного мутацией в гене аденозиндезаминазы (ген ADA).

Ряд исследователей в разных странах полагают, что сегодня наиболее реальна генотерапия муковисцидоза. Это тяжелое, рецессивно наследуемое заболевание (поражающее в странах Европы одного из 2500 новорожденных), обусловленное дефектами в гене CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator), которые приводят к поражению экзокринных желез и проявляются чаще всего в виде бронхолегочных изменений. В протоках некоторых органов (особенно в легких и поджелудочной железе) скапливается слизь. Она становится источником бактериальной инфекции, которая с трудом поддается лечению антибиотиками .

Например, для лечения легочной формы муковисцидоза лечебный ген, включенный в липосомы, вводят в дыхательные пути в форме аэрозоля. Однако до клинических испытаний предстоит еще решить непростые вопросы взаимодействия генетических препаратов с клетками, устойчивости эффекта и т.д.

В настоящее время успешно разрабатываются, в том числе и в нашей стране, генно-инженерные подходы лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Это заболевание, сцепленное с Х- хромосомой, приводит к ранней инвалидности и летальному исходу в возрасте до 20 лет одного из каждых 3500 новорожденных мальчиков.

• Один из возможных подходов к терапии этой болезни – восстановление экспрессии дистрофина путем трансплантации миобластов в мышцы.
• Описан положительный терапевтический эффект, когда мальчику в возрасте 6-14 лет имеющим это заболевание, трансплантировали в мышцы нормальные миобласты, взятые от братьев или отца и выращенные в культуре до нужного количества

Другой генно-инженерный подход лечения мышечной дистрофии Дюшенна– ген дистрофина вводят непосредственно в скелетные мышцы с мышечной дистрофией путем инъекции. Процедура должна неоднократно повторяться. Векторная ДНК попадает в кровь и разносится по всему организму. В опытах на мышах показано, что увеличение количества гена дистрофина происходило не только в скелетных мышцах, но также в диафрагме и в сердце, поражение которых – одна из частых причин смерти. Ген дистрофина экспрессируется и оказывает терапевтический эффект.

При лечении «семейной гиперхолестеринемии», обусловленной мутацией белка рецептора, который в клетках печени должен связывать частицу, переносящую холестерин в плазме крови, у больного отсекают 200-300 г печени. Гепатоциты (клетки печени) культивируют и подвергают трансформации в лабораторных условиях. В них вводят нормальный ген, используя в качестве вектора аденовирус или путем бомбардировки клеток из специальной «генной пушки» золотыми пульками, т.е. частицами золота с нанесенными на них фрагментами ДНК, включающими лечебный ген.

В СМИ 2001 г. появились сенсационные сообщения о рождении в США первых генетически модифицированных детей. Генно-инженерный подход использован для преодоления врожденного бесплодия женщин, вызванного дефектом митохондрий.

Генетически модифицированные дети появились у обреченных на бесплодие матерей благодаря переносу в их яйцеклетки ДНК недефектных митохондрий.

Опасности генетической инженерии

1. В результате искусственного добавления чужеродного гена непредвиденно могут образоваться опасные вещества.

2. Могут возникать новые и опасные вирусы

3. Знания о действии на окружающую среду модифицированных с помощью генной инженерии организмов, привнесенных туда, совершенно недостаточны.

4. Не существует совершенно надежных методов проверки на безвредность.

5. В настоящее время генная инженерия технически несовершенна, так как она не в состоянии управлять процессом встраивания гена, поэтому невозможно предсказать результаты.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!