МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ОКРАШИВАНИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии. Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы. Красители, применяемые в микробиологии, являются солями двух типов:
1) КИСЛЫЕ КРАСИТЕЛИ – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).
2) ОСНОВНЫЕ КРАСИТЕЛИ– те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий). Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl). Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми). Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСЯЩИХ РАСТВОРОВ
При бактериологическом исследовании для окраски микробов применяются основные анилиновые краски. Чаще всего употребляются: основной фуксин (красная краска), метиленовая синь (синяя краска), генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет (фиолетовые краски). Эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, из которых готовят красящие растворы. Исходным материалом для приготовления необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы указанных красителей. Спиртовые растворы готовят впрок и сохраняют в склянках с притертыми пробками. Сами по себе спиртовые растворы для окраски микробов не применяются.
НАСЫЩЕННЫЙ СПИРТОВОЙ РАСТВОР КРАСИТЕЛЯ получают растворением 1 г его в 10 мл 96%-ного этилового спирта (этанола). Краска обычно полностью не растворяется, и на дне флакона остается небольшой осадок. Полученный спиртовой раствор настаивают 3-5 дней, ежедневно взбалтывая.
РАБОЧИЙ ВОДНО-СПИРТОВОЙ РАСТВОР КРАСКИполучают смешивая 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды. Для повышения красящей способности в качестве протравы к водно-спиртовым растворам красок добавляют карболовую кислоту.
РЕЦЕПТЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ НАИБОЛЕЕ УПОТРЕБИТЕЛЬНЫХ КРАСОК
КАРБОЛОВЫЙ ФУКСИН ЦИЛЯ – 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты. Можно приготовить красящий раствор и непосредственно из сухого красителя. Для этого 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты. Для лучшего растирания рекомендуется добавить несколько капель глицерина. Затем понемногу приливают 10 мл 96%-ного спирта. К равномерно растертой массе постепенно приливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 1-2 суток. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стоек и может сохраняться очень долго. Его употребляют для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий, трудно воспринимающих краску.
ФУКСИН ПФЕЙФЕРА (РАЗВЕДЕННЫЙ ФУКСИН) – 1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллированной воды. Раствор нестоек, поэтому его приготовляют непосредственно перед окраской препаратов. Используют для простой окраски мазков и дополнительной окраски их по методу Грама.
КАРБОЛОВЫЙ ГЕНЦИАНВИОЛЕТ – 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты или 1 г генцианвиолета растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты, постепенно добавляют 10 мл 96%-ного спирта и 100 мл дистиллированной воды.
ЩЕЛОЧНАЯ МЕТИЛЕНОВАЯ СИНЬ (ПО ЛЕФЛЕРУ) – к100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-ного раствора едкого кали (КОН). Раствор фильтруют. Краска очень прочная, причем красящая способность старой краски выше, чем свежеприготовленной.
ВОДНЫЙ РАСТВОР МЕТИЛЕНОВОЙ СИНИ – 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
РАСТВОР ЛЮГОЛЯ – 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавив 1 г кристаллического йода. Объем доводят водой до 300 мл. Раствор Люголя должен иметь слабощелочную или нейтральную реакцию. При кислой реакции его нейтрализуют (по лакмусу) двууглекислой содой. Раствор следует хранить в склянках из темного стекла, предохраняя от действия света.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРОПИТАННОЙ ГЕНЦИАНВИОЛЕТОМ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ ДЛЯ ОКРАСКИ МИКРОБОВ ПО ГРАМУ В МОДИФИКАЦИИ СИНЕВА– раствор карболового генцианвиолета помещают на сутки в термостат при 37 °С, затем фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат выливают в тарелку и погружают в него нарезанную полосками фильтровальную бумагу на 1-2 мин. Пропитанная краской бумага подсушивается, нарезается кусочками (2х4 см) и сохраняется в темных склянках с притертой пробкой. Срок хранения неограниченный.
ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин. Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов. Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению.
СПОСОБ NAKANISCHI (СПОСОБОВ ПРИЖИЗНЕННОЙ ОКРАСКИ)При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет. Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.
Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Леффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.
МЕТОД ЛЕФФЛЕРА (LOFFLER) – применяютраствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.РАСТВОР А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл. РАСТВОР Б: КОН (0,01%) – 100мл.
Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой. Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.
Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.
ПО СПОСОБУ БУРИ – фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается, как бы негативное их изображение. При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2. Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости. Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец, а темном фоне препарата.
Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.
ОКРАСКА ПО РЕБИГЕРУ – не фиксированные мазки окрашивают (и одновременно фиксируют) формалинизированным генцианвиолетом 15-20 сек., быстро промывают водой и подсушивают. Бактерии густо-фиолетовые, капсулы красновато-фиолетовые.
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
Большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток. Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Данные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения).
ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА «РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ»
На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физического раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне.Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают. Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла). Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин. После фиксации мазок готов к окрашиванию.
МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ГРАМУ – особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например, стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.
На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.
Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.
Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.
Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.
После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.
МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО БУРРИ-ГИНСУ – некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.
На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.
Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.
Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.
Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.
МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ОЖЕШКО – этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.
На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.
Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.
Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.
После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.
МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ ДЛЯ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ (возбудители туберкулеза и проказы) – особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.
Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.
Дают препарату остыть, промывают водой.
Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.
Препарат промывают водой.
окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.
Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
При окраске кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).
ОКРАШИВАНИЕ ПО РОМАНОВСКОМУ – ГИМЗЕ Цитологический метод окрашивания микроорганизмов, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) для изучения методом световой микроскопии. Предложена в 1904 году Густавом Гимзе (раствор Гимзе для окраски по Романовскому).Краска Романовского-Гимзе состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции (pH 7,0 – 7,2) прибавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского-Гимзе. Приготовленный раствор краски тотчас же наливают на фиксированный мазок или лучше предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с краской. Через 1 ч краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Приготовление красителя – готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Специальный стандартный раствор Гимзе (состав красителя):
Азур 1 — 3,772 г
Эозин — 2,165 г
Метиленовая синька — 1,563 г
Метанол (ЧДА) — 750,0 мл
Глицерин (ЧДА) — 256,0 мл
7 167
5 302 
