Копрологические методы исследования

КОПРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Прижизненный диагноз на большинство гельминтозов устанавливается коп-рологическими методами исследования путем обнаружения гельминтов или их фрагментов (гельминтоскопия), половых продуктов — яиц (овоскопия) или личинок (ларвоскопия).

ГЕЛЬМИНТОСКОПИЯ

В свежевыделенных фекалиях животных можно обнаружить членики цестод (аноплоцефалид). Иногда с фекалиями могут выделяться крупные нематоды (параскарисы, оксиуриды, стронгилиды). Однако такое явление имеет случайный характер и происходит по разным причинам, не связанным с биологическими особенностями паразитов.

Крупных гельминтов легко обнаруживают при обычном просмотре фекалий, выделенных в утренние часы, после ночного отдыха животных.

Членики цестод и мелких нематод обнаруживают методом последовательного промывания фекалий. Гельминтов выбирают из осадка и дифференцируют по морфологическим признакам.

ГЕЛЬМИНТООВОСКОПИЯ

Большинство гельминтозов прижизненно диагностируется овоскопическими методами. В зависимости от удельного веса яиц гельминтов их выделяют из фекалий либо методами осаждения, либо всплывания (флотации) (рис. 292).

Яйца трематод более тяжелые, поэтому их выделяют осаждением, используя метод последовательных смывов.

МЕТОД ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ СМЫВОВ. Для выполнения исследований потребуются:

а) ступка с пестиком (при их отсутствии можно обойтись консервной банкой и ложкой);

б) воронка;

в) стеклянный стакан на 100-150 мл (лучше цилиндрический);

г) металлическая сетка или марлевая салфетка размерами 12 х 12 см;

д) предметные стекла.

Рис. 292 Яйца гельминтов однокопытных животных:

Из прямой кишки животного берут 1015 г фекалий и размешивают с десятикратным количеством воды (в ступке, стакане, банке). Взвесь фекалий фильтруют через металлическое сито или один слой марли в цилиндрический стакан и отстаивают в течение 5-10 минут (продолжительность отстаивания зависит от густоты и состава фекалий). Отстоявшийся верхний слой жидкости осторожно сливают до осадка, к которому вновь добавляют такое же количество воды. Процедуру последовательного промывания повторяют до тех пор, пока после очередного отстаивания верхний слой жидкости не станет прозрачным. Последний раз медленно и осторожно сливают воду так, чтобы на дне стакана осталось 1-2 мл осадка, который небольшими порциями размещают на предметных стеклах и просматривают под микроскопом при малом увеличении. Для ускорения просмотра осадка можно использовать специально подготовленные стекла большого размера (5 х 10-12 см), вырезанные из оконного стекла. На таких стеклах можно разместить и просмотреть сразу весь осадок.

Метод последовательных смывов применяется для диагностики фасциолеза и дикроцелиоза животных.

Яйца фасциол — крупного размера, правильной овальной формы, с крышечкой на одном из полюсов, зернистой массой внутри и оболочками золотисто-желтого цвета.

Яйца дикроцелий — мелкие, асимметрично-овальной формы, с личинками-мирацидиями внутри и оболочками коричневого цвета.

Для выявления яиц большинства гельминтов и ооцист кокцидий используют копрологические методы всплывания (флотации). Наиболее простыми по выполнению копрологическими методами исследования на гельминтозы, не требующими специального оборудования и материалов, являются методы Фюллеборна и Котельникова. Оба метода исследования фекалий могут быть использованы в условиях производства. Оборудование, необходимое для выполнения исследования этими методами, такое же, как при методе последовательного промывания. Для флотации яиц гельминтов необходимо приготовить растворы солей с определенной плотностью.

МЕТОД ФЮЛЛЕБОРНА. Для выполнения исследования методом Фюллеборна готовят насыщенный раствор поваренной соли (NaCl). В посуду с кипящей водой кладут поваренную соль (из расчета 400-420 г соли на 1 л воды) и продолжают кипятить при слабом нагревании до тех пор, пока соль не прекращает растворяться (на дне посуды остается нерастворенная соль, а на поверхности жидкости появляется тонкая пленка). Раствор роли в горячем состоянии фильтруют через слой ваты или марлю. После остывания раствора на дне посуды выпадает осадок соли (признак правильности приготовления раствора нужной концентрации). Используют в работе надосадочную жидкость без взмучивания осадка.

Порцию исследуемых фекалий в количестве около 10 г помещают в ступку, добавляют около 80-100 мл насыщенного раствора поваренной соли и тщательно перемешивают с помощью пестика (без интенсивного растирания фекалий) до равномерной взвеси. Взвесь фильтруют через металлическое сито или один слой марли в цилиндрический стаканчик (или банку) емкостью 100-150 мл и отстаивают в течение 10-15 минут, после чего с поверхности жидкости снимают копроло-гической петлей пленку, переносят ее на предметное стекло для микроскопического исследования. Желательно исследовать не менее трех пленок, снятых с разных участков поверхности жидкости в стаканчике. Стандартную копрологическую петлю можно изготовить из тонкой медной проволоки (одна жилка многожильного электрического провода) длиной 10-12 см, скрутив на ее конце кольцевую петлю на круглом карандаше и подогнув петлю под углом 90°. Петля многоразового пользования. Перед использованием ее прожигают на пламени горелки или тщательно промывают.

Пленка жидкости, помещенная на предметное стекло, должна немедленно исследоваться, так как в ней, при подсыхании, выпадают кристаллы соли, затрудняющие обнаружение яиц гельминтов. Методом Фюллеборна выделяются далеко на все яйца гельминтов, поэтому предпочтение следует отдать его модификации — методу Котельникова, который выполняется по такой же методике, но в качестве флотационной жидкости используется раствор аммиачной селитры. Плотность применяемого раствора селитры значительно больше, чем насыщенного раствора поваренной соли, поэтому в нем всплывают яйца почти всех гельминтов (кроме яиц трематод).

МЕТОД КОТЕЛЬНИКОВА. Готовят флотационную жидкость, растворяя гранулированную аммиачную селитру (используемую в агрономии в качестве минерального удобрения) в горячей воде. На 1 л воды берут 1500 г селитры. Селитру растворяют постепенно при постоянном подогревании (но не кипячении!) воды и хранят в плотно закупоренной посуде.

Исследование фекалий методом Котельникова производят так же, как и методом Фюллеборна, но фекалии берут в количестве 5 г, а раствора селитры не более 50 мл. Взвесь фекалий во флотационном растворе отстаивают в течение 10 минут. Преимуществом метода Котельникова являются не только более высокая эффективность и универсальность, но и то, что поверхностная пленка жидкости при отстое не содержит крупных всплывших частиц фекалий и пены, мешающих обнаружению яиц паразитов.

Флотационными методами в фекальных массах животных обнаруживают яйца нематод — параскарисов, стронгилят, стронгилоидесов, драшей и габронем, а также яйца цестод.

Яйца параскарисов — среднего размера, округлой формы, с толстыми оболочками, желто-коричневого цвета. Внутри яйца просматривается мелкозернистый зародышевый шар, иногда на стадии дробления.

Яйца стронгилят — среднего размера, продолговато-овальной формы, с тонкими двухконтурными оболочками, серого цвета. Внутри яиц виден зародышевый шар на стадии дробления («шары дробления»). Яйца всех стронгилят имеют одинаковое строение, и определить их родовую принадлежность невозможно. Диагноз устанавливается только до подотряда — «стронгилятозы».

Прижизненную родовую принадлежность яиц стронгилят определяют по инвазионным личинкам, выращенным в фекалиях животных при определеных условиях.

Яйца стронгилоидесов мелкие, округло-овальной формы, с тонкими, гладкими оболочками, серого цвета. Внутри яиц просматривается личинка, свернутая в форме «шпильки».

Из яиц стронгилоидесов во внешней среде при благоприятных условиях уже за 6-7 часов может выйти личинка.

Яйца драшей и габронем мелкие, продолговато-овальные, с притуплёнными концами, с тонкими, нежными оболочками, светло-серого цвета, с личинками внутри, свернутыми в форме «шпильки». Хотя яйца драшей и габронем выявляются методами флотации (по методу Котельникова), концентрированные растворы солей их деформируют. Поэтому для выделения их из фекалий рекомендуется специальный метод Горшкова (см. ларвоскопический метод Бермана-Орлова).

Яйца аноплоцефалид. Яйца цестод-аноплоцефалид среднего размера, неправильной формы в виде многогранников (в проекции обычно четырехугольные с закругленными углами), с тонкими оболочками, темно-серого цвета. Внутри просматриваются онкосферы округлой формы, заключенные в собственные оболочки с боковыми выступами в виде рожков («грушевидный аппарат»).

Яйца оксиурисов — среднего размера, овально-асимметричной формы, с толстыми двухконтурными оболочками, светлосерого цвета, со слизистой пробочкой на одном из полюсов. Внутри яйца просматривается мелкозернистая масса. Яйца оксиурисов обнаруживают на коже прианальной области тела, соскабливая их с кожи деревянной палочкой или ватным тампончиком, смоченным 50% -ным раствором глицерина. Из соскоба готовят раздавленную каплю на предметном стекле и исследуют под микроскопом. В фекальных массах инвазированных животных яйца оксиурисов обнаруживаются редко.

ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЯ

Для выделения из фекалий, внутренних органов и тканей личинок гельминтов используют методы гельминтоларвоскопии. Чаще всего для этой цели используют методы Бермана-Орлова и Щербовича.

Фекалии для исследования следует брать из прямой кишки животного и исследовать в свежем виде так, чтобы они находились во внешней среде не более 68 часов. При соблюдении этого условия все обнаруженные личинки будут принадлежать легочным гельминтам, дифференцировать которых несложно. В полежавших во внешней среде фекалиях появляются личинки гельминтов пищеварительного тракта, от которых необходимо будет отличать личинок диктиокаул, что значительно усложнит диагностику.

МЕТОД БЕРМАНА-ОРЛОВА. Для исследования фекалий методом Бермана-Орлова требуются: а) воронка, на конец которой надета резиновая трубка длиной 12-15 см; б) коническая центрифужная пробирка или зажим для резиновых трубок; в) металлическое ситечко или марлевая салфетка размером 20 х 20 см; г) штатив или другое приспособление для фиксации воронки в вертикальном положении.

На конец резиновой трубки надевают центрифужную пробирку, плотно заклинив ее (или при отсутствии пробирки устанавливают зажим). В воронку наливают воду комнатной температуры или подогретую до 35-40°С, устанавливают ситечко, так чтобы оно было слегка погруженным в воду, и на нем размещают фекалии от животных в количестве 5-10 г. При отсутствии сита фекалии заворачивают одним слоем марли и погружают в воду. Фекалии выдерживают в воде в течение 6-12 часов, после чего осторожно, пережав резиновую трубку, снимают пробирку. Жидкость в пробирке отстаивают 510 минут или центрифугируют при 1000 оборотах в течение минуты. Верхний слой жидкости в пробирке осторожно одним приемом сливают так, чтобы в пробирке осталось 0,5-1 мл жидкости, которую выливают на предметные стекла для микроскопии (лучше, если для этой цели используют специально вырезанные стекла больших размеров, на которые можно сразу разместить всю исследуемую часть материала).

Метод Бермана-Орлова чаще используется в условиях лабораторий. В производственных условиях обычно применяют его модификации.

Этим же методом исследуют фекалии однокопытных животных при диагностике драшейоза и габронематоза. В воронку наливают воду комнатной температуры. Устанавливают металлическую сетку, так чтобы она была погружена в воду, на ней рыхло размещают 100-200 г фекалий и выдерживают до 10-12 часов. Яйца нематод вымываются из фекалий и оседают на дно пробирки. Исследуют осадок, осевший на дно пробирки.

МЕТОД ЩЕРБОВИЧА. Для выполнения исследования методом Щербовича требуются:

а) конический или цилиндрический стаканчик емкостью на 50-100 мл;

б) марлевая салфетка (15 х 15 см);

в) предметные и покровные стекла;

г) отрезок тонкой мягкой медной проволоки длиной 10 см.

В стаканчик наливают воду комнатной температуры или подогретую до температуры 35-40°С, в количестве 2/3 емкости посуды. Фекалии, взятые из прямой кишки животного, заворачивают в один слой марли, обвязывают медной проволокой, так чтобы часть проволоки осталась свободной. Свободный конец проволоки загибают крючком, на который и подвешивают завернутые в марлю фекалии на край стакана, чтобы они касались воды. Фекалии в подвешенном состоянии оставляют на 5-6 часов, после чего осторожно удаляют, а оставшуюся в стаканчике жидкость отстаивают еще 5-10 минут. После отстоя верхний слой жидкости осторожно сливают, так чтобы в стаканчике осталось 0,5-1 мл осадка, и переносят его на предметные стекла для микроскопии.

Методом ларвоскопии обнаруживают в фекалиях животных личинок нематоды-диктиокаулы, паразитирующей в бронхах.

Личинки диктиокаулов размером 0,4 мм в длину, с короткими заостренными хвостовыми и закругленными головными концами, темно-серого цвета. Тело личинок заполнено зернистой массой (кроме головного и хвостового концов). Внутреннее строение личинок плохо просматривается. Личинки обладают медленным змеевидным движением.

Ларвоскопическими методами можно выделить из различных органов и тканей мигрирующих личинок некоторых нематод (из легких, печени и других органов.

Рис. 293

ЛИЧИНКИ НЕМАТОД ОДНОКОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ

Кровь животных исследуют при подозрении на парафиляриоз и сетарйоз.

Диагностика парафиляриоза. Появление кровоточащих ранок на коже животного в теплое время года дает основание исследовать кровь на наличие личинок гельминтов. Для этой цели глазной пипеткой набирают из кровоточащей кожной ранки каплю крови, переносят на предметное стекло (лучше на специально вырезанное стекло большого размера, примерно 5 х 10 см), добавляют к ней 5-10 капель дистиллированной воды (для лизирования эритроцитов) и микроскопируют при слабом увеличении. Обнаруживают подвижных личинок размером около 0,2 мм, заполненных зернистой массой зеленоватого цвета, или мелкие яйца овальной формы серого цвета с личинками внутри.

Личинок сетарий (микросетарий) обнаруживают при исследовании мазков, приготовленных из периферической крови животных и окрашенных по методу Романовского-Гимза. Мазки желательно готовить в вечернее время, когда количество микросетарий в периферической крови увеличивается. Личинки сетарий длиной около 0,3 мм, зернистой структуры, с чехликом, хорошо видимым на головном и хвостовом концах. В задней части личинок видны 4-5 крупных клеток.

ИССЛЕДОВАНИЕ КОЖИ

При подозрении на онхоцеркоз исследуются кусочки кожи методом дермоларвоскопии с целью обнаружения личинок онхоцерков (микроонхоцерков). Для этого на пораженных участках кожного покрова в области холки, плеч, передних конечностей с помощью ножниц или скальпеля вырезают кусочек кожи размером с мелкую горошину и толщиной 2-3 мм.

Вырезанный кусочек кожи помещают в пробирку с небольшим количеством физраствора и выдерживают в течение 1-2 часов в термостате при температуре 36-3 7°С, после чего исследуют осадок. В положительном случае при микроскопии обнаруживают подвижных личинок зернистой структуры (без чехлика), размером около 0,25 мм.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛАЗ

Исследование глаз производится при подозрении на телязиоз с целью обнаружения гельминтов или их личинок.

Гельминтов можно вымыть из конъюнктивального мешка 1%-ный раствором борной кислоты с помощью резиновой груши с мягким наконечником. Конец груши вводят в конъюнктивальный мешок и струей раствора борной кислоты промывают глаз. Вытекающую жидкость собирают в подставленную кювету и внимательно просматривают. Вымытые из глаза нитевидные нематоды размером около 1,5 см в длину активно двигаются и легко обнаруживаются.

Личинок телязий можно обнаружить при микроскопическом исследовании слезной жидкости, взятой из глаза животного. Для этого глазной пипеткой осторожно собирают слезную жидкость из внутреннего угла глаза, помещают на предметное стекло и микроскопируют. Личинки телязий размером около 0,3 мм, зернистые, с чехликом, активно двигаются.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЛИЧИНОК НЕМАТОД ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА ОДНОКОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ

Яйца стронгилят пищеварительного тракта однокопытных животных имеют схожее строение, и определить их родовую принадлежность невозможно. Прижизненно определить стронгилят, паразитирующих в кишечнике, можно только по инвазионным личинкам, выращенным при благоприятных для них условиях в фекалиях инвазированных животных.

Для культивирования личинок от животных берут порцию свежевыделенных фекалий (около 50 г), кладут (рыхло) в чашки Петри, так чтобы фекалии только слегка касались крышек. Чашки ставят в термостат или в теплое затемненное место в помещении, чтобы температура была на уровне 22-26°С, и выдерживают в течение 8-10 суток. Периодически фекалии, по мере подсыхания, слегка увлажняют легким обрызгиванием, не допуская избытка жидкости в чашках. Появление небольшого количества плесени на фекалиях не мешает развитию личинок нематод.

По окончании срока культивирования личинок выделяют из фекалий ларвоско-пическим методом Бермана-Орлова. Однако часто в этом нет необходимости, так как инвазионные личинки мигрируют на увлажненную конденсированной жидкостью внутреннюю поверхность крышек, откуда их легко собрать для микроскопического исследования. Неинвазионных личинок на крышках обычно не бывает. Личинок можно культивировать и в закрытых стаканах, стеклянных банках, не допуская высыхания и переувлажнения фекалий.

Личинок после культивирования определяют до рода по морфологическим признакам (размерам различных частей тела, строению кишечника). Инвазионные личинки активно передвигаются. Чтобы детально изучить строение личинок, перед просмотром их обездвиживают. Для этого к капле жидкости с личинками добавляют небольшую каплю раствора Люголя (можно использовать настойку йода, разбавленную водой до бледно-желтого цвета).

Рис. 294

Инвазионные личинки нематод пищеварительного тракта однокопытных животных:

При добавлении раствора йода личинки прекращают движение и распрямляются, приобретая желтоватую окраску. Избыточная концентрация йода окрашивает личинок в темно-коричневый цвет, мешающий изучению их строения. Из исследуемой жидкости с выделенными личинками на предметных стеклах готовят раздавленные капли. Препараты просматривают при малом и среднем увеличениях, слегка опустив конденсер микроскопа.

На рисунке 294 и в таблице 69 представлены особенности морфологического строения инвазионных личинок стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидесов однокопытных животных.

Таблица 69

Морфологическое строение инвазионных личинок нематод пищеварительного тракта однокопытных животных

Инвазионные личинки стронгилят пищеварительного тракта крупные, покрыты чехликами, которые хорошо видны в местах изгиба тела личинок в виде мелких складок.

У личинок делафондий 32 кишечных клетки четырехугольной формы, расположенных в два ряда.

Личинки стронгилид имеют 16 кишечных клеток четырехугольной формы, также расположенных в два ряда. Тело личинки узкое, вытянутое. Личинки очень подвижны.

У личинок альфортий можно различить 20 слабо выраженных, почти бесформенных кишечных клеток. Личинки обладают быстрым поступательным движением.

Личинки трихонем имеют 8 кишечных клеток треугольной формы, сравнительно длинные пищевод и хвостовой конец. Передвигаются медленно.

Вместе с личинками стронгилят при культивировании часто развиваются и личинки стронгилоидесев. Они значительно меньше личинок стронгилят, тонкие, без чехликов. Третью часть тела их занимает пищевод. Хвостовой конец короткий и острый. Личинки стронгилоид очень подвижны. Энергично извиваясь, они стремительно передвигаются. При культивировании инвазионные личинки стронгилоид активно мигрируют на стенки и крышки посуды.